Alternative Assemblierungs-Mechanismen von pathologischen Desmin-Mutanten: Filamentbildung im Wettbewerb mit Aggregation
Coordinator
Professor Dr. Harald Herrmann ; Professorin Dr. Sarah Köster
Grant period
2019 - 2024
Funding body
Deutsche Forschungsgemeinschaft
DFG
Identifier
G:(GEPRIS)429958739
Note: Intermediärfilamente (IFs) stellen eines der drei prinzipiellen Filamentsystemen dar, welche die funktionelle Architektur von Säugerzellen organisieren. Im Muskel bildet das Protein Desmin ein stark Stress-abfangendes IF-System, welches die einzelnen Myofibrillen umhüllt und an zentrale Ankerstrukturen, wie die Z-Banden und die Costamere der Plasmamembran, koppelt. Mutationen im Desmin-Gen bewirken in der Regel die Änderung einzelner Aminosäuren und dies führt zur Entwicklung schwerer Myopathien, wobei häufig das Herz zentral betroffen ist. Auf zellulärer Ebene drückt sich die Krankheit durch massive Desmin- Aggregate und Störungen des myofibrillären Apparats in Myozyten aus. Wir haben in der Vergangenheit mit einer Reihe von biochemischen und biophysikalischen Methoden gezeigt, dass man die Mutationen in vier Gruppen einteilen kann. Dabei werden die verschiedenen Phasen der IF-Assemblierung und Netzwerkbildung betrachtet, in der die jeweilige Mutation den geordneten Prozess stört. Die ersten drei Phasen beschreiben (i) die laterale Assoziation der tetrameren Protein-Komplexe zu „unit-length filaments” (ULFs), (ii) die anschließende Elongation von ULFs zu Filamenten und (iii) die radiale Reorganisation (“Kompaktion”), die während des Elongationsprozesses stattfindet. (iv) In der vierten Phase konstituieren die Filamente funktionelle Netzwerke. Während die erste Phase innerhalb einer Sekunde abgeschlossen ist, wie „stopped-flow“ Experimente gezeigt haben, verläuft die zweite Phase über mehrere Minuten bis sie fließend in die dritte Phase übergeht. Um die molekularen Vorgänge bei der Bildung von Aggregat-Strukturen besser zu verstehen, schlagen wir hier vor, vier ausgewählte Desmin-Mutanten zu untersuchen, die den normalen Assemblierungsprozess im Verlauf jeweils einer der vier Phasen verlassen. Mit Hilfe von Elektronenmikroskopie, „stopped-flow“ Experimenten, Mikrofluidik, Röntgenstreuung und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, werden wir die Proteine in vitro biophysikalisch untersuchen. Ergänzend dazu werden wir Zellen untersuchen, die die jeweiligen Mutanten exprimieren, und zwar sowohl in stabil transfizierten Zellen als auch in aus der R350P-Desmin Knock-in-Maus gewonnenen Zelllinien. Im Besonderen werden wir den Einfluß neuer IF-gängiger chemischer Verbindungen und Arzneistoffe auf die Desmin-Aggregation als auch auf die Anordnung prominenter Zytoskelett-Proteine zeitabhängig mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie verfolgen. Außerdem werden wir die Auswirkungen der Aggregate auf die innere Struktur der Zellen mit Hilfe von Raster-Röntgen-Kleinwinkel-Streuung („scanning SAXS“) untersuchen. Mit diesem kombinierten Ansatz erwarten wir, wichtige Einsichten in die Abfolge der normalen Assemblierungsschritte sowie in die Sequenz der Fehlassoziationen während der Aggregatbildung eines der für die mechanische Stabilität wichtigen Filamentsysteme von Muskelzellen zu erlangen.
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