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@PHDTHESIS{Neissner:638331,
author = {Neissner, Konstantin},
title = {{S}tructural and dynamical analysis of protein-ligand
interactions by {NMR}-spectroscopy and{X}-ray
crystallography},
school = {Johann Wolfgang-Goethe-Universität Frankfurt},
type = {Dissertation},
reportid = {PUBDB-2025-04049},
pages = {1-182},
year = {2025},
note = {Dissertation, Johann Wolfgang-Goethe-Universität
Frankfurt, 2025},
abstract = {Jedes Lebewesen steht im ständigen Austausch mit seiner
Umwelt und ist sich veränderndenUmweltbedingungen
ausgesetzt. Dies gilt insbesondere für einzellige
Organismen wieBakterien aber auch für einzellige
Eukaryoten. Denn diese besitzen keine spezialisiertenOrgane
und sind somit Änderungen in ihrem Lebensraum ganzheitlich
ausgesetzt. DieseÄnderungen können steigende oder fallende
Temperaturen, pH-Werte, Salzkonzentrationenoder das
Vorhandensein von Umweltgiften, antibiotischen Substanzen
oder andereverwandte sowie nicht verwandte Zellen und
Organismen sein. Solche Veränderungen könneneinen großen
Einfluss auf Zellen und Organismen haben und deshalb ist es
notwendig sich andiese veränderten Bedingungen anzupassen.
Um diese Anpassung zu gewährleisten, müssenUmweltreize
wahrgenommen und zelluläre Prozesse reguliert werden. Dazu
haben alleLebewesen membranständige Systeme entwickelt,
welche diese Reize wahrnehmen und sieüber die Zellmembran
in das Zellinnere weiterleiten. Dort wird
eineSignaltransduktionskaskade ausgelöst, die in der
Anpassung spezifischer zellulärer Prozessegipfelt. Dazu
haben Bakterien ein sogenanntes Zweikomponentensystem
entwickelt. Diesesbesteht in seiner einfachsten Form aus
einem membranständigem und einem zytosolischenProtein. Das
membranständige Protein nimmt einen Umweltreiz mit einer
extrazellulärenDomäne wahr, wodurch eine intrazelluläre
Kinasedomäne aktiviert wird, welche durchPhosphorylierung
einen Effektor aktiviert, wodurch das Signal weitergeleitet
wird. Eineweitere Variante der Signalweiterleitung besteht
im Einsatz von sekundären Botenstoffen,welche nach der
Wahrnehmung von extra- oder intrazellulären Reizen
eingesetzt werden, umzelluläre Prozesse spezifisch zu
regulieren. Zu bakteriellen sekundären Botenstoffen
zählenkleine Moleküle wie Lipide zur Reizweiterleitung
innerhalb von Membranen oder löslicheMoleküle wie Ionen
(Ca2+, Mg2+), Nukleotide und zyklische di-Nukleotide bis hin
zu Gasen oderfreien Radikalen, welche spezielle
extrazelluläre Signalmoleküle sind. Besonders die
aufNukleotiden und zyklischen di-Nukleotiden basierenden
sekundären Botenstoffen stellen einein Bakterien
weitverbreitete und vielseitige Gruppe da. In dieser Gruppe
ist zyklisches di-Guanosinmonophosphat (c-di-GMP) der
bekannteste Vertreter. c-di-GMP ist ein reinesbakterielles
Signalmolekül, das von allen bekannten Bakterien als
sekundärer Botenstoffeingesetzt wird. Zu den Prozessen, die
es reguliert, zählen unter anderem
Zellzyklus,Zusammenfassung2Zellteilung, Zelldifferenzierung,
Biofilmbildung, Pathogenität, Mobilität und die
Regulationvon Sekretionssystemen. Um diese Vielzahl an
zellulären Prozessen in Abhängigkeit vonUmweltreizen und
Wachstumszyklus der Zellen regulieren zu können, wird ein
ausgeklügeltesNetzwerk an Enzymen eingesetzt. Dieses
Netzwerk umfasst Diguanlyatzyklasen (DGCs),welche die
Zyklisierung von zwei GTP Molekülen zu c-di-GMP
katalysieren,Phosphodiesterasen (PDEs), die c-di-GMP spalten
und abbauen, sowie natürlich Rezeptoren,die c-di-GMP binden
und in ihrer Funktion reguliert werden, um den Umweltreiz in
eineVeränderung zellulärer Prozesse umzusetzen. Die
bekannten DGCs besitzen immer eineGG(D/E)EF Domäne und PDEs
entweder eine EAL oder HD-GYP-Domäne. Im Gegensatz
dazuweisen die c-di-GMP Rezeptorproteine eine deutlich
höhere Variabilität auf. Die bisherbekannten c-di-GMP
Bindungsdomänen lassen sich in PilZ, GG(D/E)EF I-site,
degenerierte EAL,STING und MshEN Domänen zusammenfassen.
MshEN ist die N-terminale Domäne einerATPase aus Vibrio
cholerae, die mit dem Type-II Sekretionssystem assoziiert
ist. Ihre Strukturim Komplex mit c-di-GMP wurde 2016
beschrieben. Damit ist sie das neueste Mitglied derFamilie
der c-di-GMP-Rezeptoren. Im Zuge dessen wurde ein volkommen
neuer c-di-GMPBindungsmodus beschrieben mit einer
Konsensussequenz, die in vielen bakteriellen
Genomenkonserviert ist. Im Vergleich zu den anderen
bekannten c-di-GMP Bindungsmodi weist MshENeine sehr hohe
Anzahl an hydrophoben Interaktionen mit c-di-GMP auf, welche
durch eineVielzahl an Wasserstoffbrücken bei der Bindung
von c-di-GMP unterstützt werden. DurchSequenzvergleiche
wurden im N-terminalen Bereich von PilF aus Thermus
thermophilus(TtPilF) drei sogenannte „general secretory
pathway< (GSPII) Domänen mit einer hohenSequenzähnlichkeit
und hohen Konservierung der MshEN-Konsensussequenz gefunden.
TtPilFist eine ATPase, welche mit dem Type-IV
Sekretionssystem und gleichzeitig mit dem extremeffizienten
DNA-Translokator von T. thermophilus assoziiert ist. Im
Folgenden werdenausführliche strukturelle, biochemische und
funktionelle Studien bezüglich der ersten beidenGSPII
Domänen (A und B) zusammengefasst. Dazu wurden
Kernspinresonanzspektroskopie(NMR),
Röntgenkristallstrukturen, Isotherme Titrationskalorimetrie
(ITC) und in-vivo Studienkombiniert um die Domänen im
Detail zu charakterisieren.Der größte Teil dieser Arbeit
bezieht sich auf strukturelle und biochemische
Untersuchungender GSPII-B-Domäne von TtPilF (Publikation 1
und 3), welche die größte sequentielleGemeinsamkeit mit
MshEN aufweist. Durch auf NMR-Daten basierende Berechnungen
derTertiärstruktur von GSPIIB mit (holo) und ohne (apo)
gebundenem c-di-GMP und einer3Röntgenkristallstruktur der
c-di-GMP-gebundenen GSPII-B-Domäne konnte eine
exaktestrukturelle Charakterisierung durchgeführt werden.
Sowohl im apo- als auch im holo-Zustandweist die
GSPII-B-Domäne eine zu MshEN nahezu identische Faltung auf
mit kleinenUnterschieden in der relativen Orientierung der
N- und C-terminalen Subdomänenzueinander. Im Vergleich des
apo- und des holo-Zustandes unterscheiden sich lediglich
dieersten ñ-Helices, welche im apo-Zustand eine Windung
länger ist als im holo-Zustand. Somitmuss sich die erste
Windung der Helix teilweise entfalten, damit c-di-GMP in die
Bindetaschepasst. Weiterhin konnte durch einen Vergleich des
holo-Zustandes von GSPIIB und der c-di-GMP gebundenen
Struktur von MshEN gezeigt werden, dass sowohl die Faltung
als auch derc-di-GMP Bindungsmodus weitestgehend konserviert
sind. Interessanterweise konnte durchITC-Messungen für
GSPII-B eine 83-fach höhere Affinität von 6 nM zu c-di-GMP
im Gegensatzzu 500 nM für MshEN festgestellt werden, obwohl
die MshEN Konsensussequenz bis auf zweiPositionen exakt
erhalten ist. Diese beiden Positionen markieren einen
Austausch von zweiArgininen zu den zwei hydrophoben
Aminosäuren Lysin und Leucin in GSPII-B. In
MshENstabilisieren diese Arginine c-di-GMP in der
Bindungstasche durch Kationen-π-Stapelwechselwirkungen mit
den Guaninbasen, während in GSPIIB diese
Wechselwirkungendurch Lysin und Leucin hydrophober Natur
sind. Weiterführend konnte durchPunktmutationsstudien
gezeigt werden, dass diese hydrophoben
Stapelungsinteraktionenausschlaggebend sind für die extrem
hohe Affinität von GSPIIB zu c-di-GMP. Dies konnte
durchanschließende Röntgenkristallstrukturen der
GSPII-B-Mutanten auf struktureller Ebenebekräftigt werden,
da die hydrophoben Interaktionen zu einer deutlicheren
Elektronendichteführten. Zusammengefasst konnte dadurch
gezeigt werden, dass hydrophobe Interaktionenein
Schlüsselelement für die hochaffine Bindung von c-di-GMP
sein können. Dadurch konntedie MshEN-Konsensussequenz von
RLGxx(L)(V/I)xxG(I/F)(L/V)xxxxLxxxxLxxQ
zu(R/K/L)LGxx(L)(V/I)xxG(I/F)(L/V)xxxxLxxxxLxxQ erweitert
werden. Interessanterweise stelltGSPIIB somit außerdem die
erste Domäne dar, welche c-di-GMP ohne die Involvierung
vonArgininen bindet. Zusätzlich dazu konnte gezeigt werden,
dass in GSPII-B die C-terminaleSubdomäne die Bindung von
c-di-GMP fördert, wohingegen in MshEN die Bindung durch
dieC-terminale Subdomäne behindert wird.Um die Funktion der
c-di-GMP Bindung an GSPIIB genauer zu untersuchen, sollte
durch dieEinbringung weiterer Mutationen (Q190E, Q218E und
Q190E+Q218E) die Bindung von c-di-GMP beeinträchtigt
werden. Die GSPIIB-Konstrukte Q190E und Q218E wiesen bereits
einenZusammenfassung4drastischen Affinitätsverlust auf und
die Doppelmutante Q190E+Q218E verhinderte die c-di-GMP
Bindung letztendlich komplett. Durch eine Einbringung dieser
Mutationen in TtPilF in-vivo konnte gezeigt werden, dass
eine Beeinträchtigung der c-di-GMP Bindung an GSPIIB
zueiner Verringerung der Oberflächenhaftung und
Beweglichkeit der Zellen führt.Interessanterweise konnten
keine Effekte bezüglich DNA-Aufnahme oder
ATPase-Aktivitätfestgestellt werden.Durch die Einbringung
der Punktmutationen Q190E und Q218E in GSPIIB sollten
wichtigeProtein-Liganden Interaktionen durch den Austausch
eines Carboxamids durch eineCarboxylgruppe verhindert
werden. Außerdem führt dieser Austausch dazu, dass durch
dieCarboxylgruppe eine partiell negativ geladene Seitenkette
in direkter Nähe zum partiellnegativ geladenem
Ribose-Phosphat-Rückgrat von c-di-GMP positioniert ist. Die
Abstoßungzweier negativ geladener Gruppen sollte die
c-di-GMP Bindung verhindern. Allerdings konntenITC-Messungen
der Q190E und Q218E GSPII-Mutanten zeigen, dass diese, bei
einem neutralenpH-Wert (7.5), c-di-GMP immer noch mit
relativ hohen Affinitäten von 950 nM (Q190E) und460 nM
(Q218E) binden. Zur genaueren Untersuchung wurden die
Röntgenkristallstrukturender Q190E und Q218E Mutanten im
holo-Zustand bei einem neutralem pH-Wert gelöst(Publikation
3). Diese zeigen deutlich, dass in beiden Strukturen die
Carboxylgruppen derGlutamatseitenketten in Richtung des
Ribose-Phosphatrückgrats zeigen und in einerEntfernung
liegen, welche die Ausbildung von
Wasserstoffbrückenbindungen indizieren.Dadurch konnte in
Kombination mit ITC-Experimenten bei verschiedenen pH-Werten
(8.5-4.0)gezeigt werden, dass die Seitenketten der Glutamate
E190 und E218 in den GSPII-B-Mutanteneinen deutlich
veränderten pka-Wert aufweisen und schon bei neutralem
pH-Wert teilweiseprotoniert vorliegen. Durch gezielte
NMR-Experimente konnte eine Protonierung derCarbonylgruppe
für E190 eindeutig nachgewiesen werden. Dadurch konnte
gezeigt werden,dass auch Aminosäuren mit einer kanonisch
negativ geladenen Seitenkette im richtigenchemischen Kontext
bei einem neutralen pH-Wert Wasserstoffbrücken zu einem
Ribose-Phosphat-Rückgrat von Nukleinsäuren ausbilden
können. Damit konnte darauf hingewiesenwerden, dass bei der
Suche nach potentiellen DNA/RNA-Bindungsmotiven, wo der
Hauptfokusaufgrund des negativen Ribose-Phosphat-Rückgrats
traditionell hauptsächlich aufAminosäuren mit positiven
Seitenketten (Arginin, Lysin, Histidin) lag, auch Glutamate
oderAspartate berücksichtigt werden sollten.5In einer
weiteren Studie (Publikation 2) wurde die die
GSPII-A-Domäne von TtPilF, welche diegeringste
Konservierung der MshEN Konsensussequenz aufweist,
untersucht. Durch ITC- undNMR-Experimente konnte bereits
gezeigt werden, dass die GSPII-A-Domäne von TtPilF kein
c-di-GMP bindet, während GSPII-B und -C c-di-GMP mit einer
Affinität im niedrigen bismittlerem nanomolaren Bereich
binden (Publikation 1). Zur genaueren Untersuchung
derUrsachen der fehlenden Bindung wurde die Tertiärstruktur
der GSPIIA-Domäne mittels NMR-Spektroskopie ermittelt
(Publikation 2). Dadurch konnte gezeigt werden, dass die
GSPII-A-Domäne die MshEN-typische Faltung besitzt und sich
lediglich in der relativen Orientierungder Subdomänen
zueinander von MshEN und GSPII-B unterscheidet. Außerdem
konnte ineinem Vergleich des apo-Zustandes von GSPII-B und
der Struktur von GSPII-A gezeigt werden,dass in GSPII-A die
erste ñ-helix lediglich eine Aminosäure länger ist als in
GSPII-B. Doch trotzder ähnlichen Faltung konnte eine
vollständige Rekonstruktion der MshEN Konsensussequenzdie
c-di-GMP- Bindung in GSPII-A nicht wiederherstellen. Dadurch
konnte gezeigt werden,dass weitere, womöglich strukturelle,
Faktoren eine Bindung von c-di-GMP verhindern.Maßgeblich
unterscheidet sich die GSPIIA-Struktur von MshEN durch die
relative Orientierungder Subdomänen zueinander, welche in
GSPIIA durch einen engen Kontakt von ñ1 in der N-terminalen
Subdomäne und ñ7 in der C-terminalen Subdomäne
charakterisiert ist. Außerdemkonnte gezeigt werden, dass
ñ1 N-terminal durch einen idealen N-cap stabilisiert ist.
Dadurchwird ñ1 in GSPIIA stabilisiert und kann sich nicht
wie in GSPIIB entfalten. In Kombinationverhindern der enge
Kontakt zwischen ñ1 und ñ7 sowie der N-cap, dass c-di-GMP
in dieBindetasche eindringen kann. Somit ist auch bei einer
vollständigen Rekonstruktion derMshEN Konsensussequenz
GSPIIA nicht in der Lage, c-di-GMP zu binden. Durch
ausführlicheMutationsstudien, in welchen zuerst die
C-terminale Subdomäne und anschließend das N-capping
entfernt wurden, konnten diese Annahmen bekräftigt werden.
Eine Entfernung derC-terminalen Subdomäne im Kontext einer
GSPIIA-Domäne mit rekonstruierten MshEN-Motiven führte zu
einer Bindung von c-di-GMP mit einer Affinität im niedrigen
mikromolarenBereich. Zusätzlich führte eine N-terminale
Verkürzung dieses Konstruktes, wodurch der N-cap entfernt
wurde, zu einer Verbesserung der c-di-GMP Bindung mit einer
19fach höherenAffinität. Durch weitere NMR-Experimente
konnte daraufhin gezeigt werden, welchePositionen in den
Bindungsmotiven ausschlaggebend für eine hochaffine
c-di-GMP Bindungmit dem aus MshEN und GSPIIB bekannten
Bindungsmodus sind. Somit konnte anhand derGSPIIA und -B
Domänen von TtPilF die MshEN-c-di-GMP Rezeptorklasse
genauerZusammenfassung6charakterisiert werden und sowohl
Faktoren, welche für eine hochaffine Bindung notwendigsind
als auch Faktoren, welche eine Bindung verhindern,
identifiziert werden.Zusammengefasst tragen die drei
Publikationen, auf denen diese Thesis basiert, zu
einemdetaillierteren Verständnis der c-di-GMP Bindung durch
GSPII Domänen bei. Zuvor war dieDatenlage mit der Struktur
des MshEN/c-di-GMP Komplexes sehr gering und zusätzlich
fehltenStrukturdaten zu einer apo GSPII Domäne, welche in
der Lage ist c-di-GMP zu binden. Durchdie Aufklärung und
ausführliche strukturelle und biochemische
Charakterisierung von GSPII-Aund GSPII-B konnten die
Faktoren herausgearbeitet werden, welche bei GSPII-A dazu
führen,dass diese Domäne kein c-di-GMP bindet (Publikation
1) und bei GSPII-B die Faktoren, welchefür eine hochaffine
Bindung von c-di-GMP verantwortlich sind. Dadurch konnte
gezeigtwerden, dass auch homologe Proteindomänen durch
punktuelle und minimale Unterschiededeutlich
unterschiedliche Funktionen und Kapazitäten besitzen
können. Anhand derdetaillierten Charakterisierung von
GSPII-B konnte die MshEN-Konsensussequenz
erweitert,hydrophobe Protein-Ligand-Interaktionen als
Schlüsselfaktor für die hochaffine c-di-GMPBindung
herausgearbeitet (Publikation 1) und protonierte Glutamate
als potentielleMitglieder von RNA/DNA-Erkennungsmotiven
(Publikation 3) etabliert werden.},
cin = {EMBL-User},
cid = {I:(DE-H253)EMBL-User-20120814},
pnm = {6G3 - PETRA III (DESY) (POF4-6G3)},
pid = {G:(DE-HGF)POF4-6G3},
experiment = {EXP:(DE-H253)P-P13-20150101},
typ = {PUB:(DE-HGF)11},
url = {https://bib-pubdb1.desy.de/record/638331},
}
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