Record #623934

DFG project G:(GEPRIS)555503581

Etablierung eines Pyrrolochinolinchinon-abhängigen Weges für einen effizienten Alkoholstoffwechsel in Escherichia coli

Coordinator	Professor Dr.-Ing. Thomas Walther
Grant period	2025 -
Funding body	Deutsche Forschungsgemeinschaft
	DFG
Identifier	G:(GEPRIS)555503581

Note: Ethylenglykol (EG) und Methanol sind vielversprechende Ausgangsstoffe für die industrielle Bioproduktion. Zwar gibt es Bemühungen, das industriell etablierte Bakterium Escherichia coli so zu verändern, dass eine Verstoffwechselung von EG oder Methanol möglich ist, jedoch wachsen die Stämme mit geringeren Raten als Spezies, die diese Alkohole natürlicherweise assimilieren können. Im Zuge des aeroben EG- und Methanol-Stoffwechsels wird der jeweilige Alkohol zum Aldehyd oxidiert. In gentechnisch veränderten E. coli Stämmen erfolgt dies durch NAD-abhängige Alkoholdehydrogenasen. Da solche Reaktionen thermodynamisch ungünstig sind, ist die weitere Verstoffwechselung des Aldehyds (hauptsächlich durch synthetische Stoffwechselwege) aufgrund geringer Konzentrationen schwierig. Im Projekt wird dieses Problem adressiert, indem ein nicht-kanonisches Pyrrolochinolinchinon (PQQ)-abhängiges System in E. coli implementiert wird, dass die Alkohole irreversibel oxidieren kann. Für die Funktion des PQQ-basierten Oxidationssystems sind mehrere Komponenten notwendig, von denen keine natürlicherweise in E. coli vorkommt: eine PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase, ein PQQ-Syntheseweg, sowie ein Cofaktor-regenerierender Stoffwechselweg bestehend aus Cytochrome-c-Proteinen und einer Cytochrome-c-terminalen Oxidase. Pseudomonas putida besitzt ein PQQ-abhängiges Alkholdehydrogenase-Enzym (PedE), welches auf EG oder Methanol aktiv ist. Nach einer Charakterisierung der Komponenten der PQQ-Regeneration in P. putida, werden wir uns mit deren Expression und der funktionellen Charakterisierung in E. coli beschäftigen. Alkoholoxidation und PQQ-Regeneration finden im Periplasma statt. Zur Expression des Cytochrom-c-Reifungssystem sollen PedE- und c-Typ-Cytochrom-Proteine entwickelt werden, die durch das Anhängen von Signalpeptiden in das Periplasma von E. coli-Stämmen mit reduzierter Proteolyse transportiert werden. Nach Expression von terminaler Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität soll die in vivo-Oxidation von EG zu Glykolaldehyd möglich sein, wenn PQQ zum Kulturmedium gegeben wird. Schließlich werden wir den PQQ-Syntheseweg mit den oben beschriebenen Elementen koexprimieren, um eine autonome Funktion des PQQ-abhängigen Alkoholoxidationssystems in E. coli zu ermöglichen. Da die Glykolaldehyd-Produktionsraten zunächst voraussichtlich gering sein werden, haben wir einen Glykolaldehyd-abhängigen wachstumsbasierten Assay konzipiert. Sobald eine Verbesserung erreicht ist, werden wir die gesamte Reaktionssequenz in prototrophe E. coli implementieren, um zu zeigen, dass EG als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle für die Biomassebildung dienen kann. Eine weitere Verbesserung des Weges soll durch adaptive Laborevolution erfolgen. Die Stämme sollen durch DNA-Sequenzierung und Proteomanalysen untersucht werden. Schließlich wollen wir durch 13C-Tracer-Analyse die Methanolassimilation durch E. coli mit Hilfe des PQQ-abhängigen Oxidationssystems und der Glykolaldehyd-Synthase nachweisen.

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Record created 2025-02-24, last modified 2025-02-24

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