Record #529720

DFG project G:(GEPRIS)262245765

Lipid-Interaktionen des humanen G-Protein-gekoppelten Rezeptors CXCR1 in asymmetrischen Vesikeln

Coordinator	Dr. Sebastian Fiedler
Grant period	2014 - 2017
Funding body	Deutsche Forschungsgemeinschaft
	DFG
Identifier	G:(GEPRIS)262245765

Note: Die meisten biologischen Membranen weisen einen hohen Grad an Asymmetrie auf. Beispielsweise besteht die äußere Lipidschicht von Säugetierzellmembranen hauptsächlich aus Phosphatidylcholin und Sphingomyelin, wohingegen in der inneren Lipidschicht Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin dominieren. Zusätzlich zur Vermittlung struktureller Membraneigenschaften beeinflusst die Membranasymmetrie die Orientierung von Membranproteinen, die Bildung von Nanodomänen, die Bindung von Proteinen an die Membran und viele weitere zelluläre Prozesse. Jedoch existierte bis vor kurzem kein vernünftiger Ansatz zur Herstellung asymmetrischer Lipidvesikel, welche wichtige Modellsysteme sind, um Interaktionen zwischen Membranproteinen und Lipiden zu untersuchen. Im hier vorgeschlagenen Projekt erzeugen wir asymmetrische Proteoliposomen, die einen humanen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) enthalten. Hierfür tauschen wir mittels Methyl-beta-Cyclodextrin (MbetaCD) die äußere Lipidschicht der Proteoliposomen aus. Dabei ändern wir systematisch die Zusammensetzung der äußeren Lipidschicht der Proteoliposomen und überprüfen deren Einfluss auf die Ligandenbindung und die GPCR-Oligomerisierung. Darüber hinaus analysieren wir, wie der Rezeptor die Neigung bestimmter Lipide moduliert, sich in die äußere Lipidschicht von Proteoliposomen einzulagern. Mit dem Chemokinrezeptor CXCR1 untersuchen wir einen wichtigen Vermittler von Immun- und Entzündungsreaktionen. Zur Aktivierung bindet CXCR1 an Interleukin-8 (IL-8), was in direktem Zusammenhang mit der Membranoberfläche steht, da beobachtet wurde, dass der IL-8-gebundene N-Terminus des Rezeptors von der Membran dissoziiert. Um die molekularen Vorgänge während dieser Bindung genauer zu beleuchten, erstellen wir mittels isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) thermodynamische Bindungsprofile in verschieden asymmetrischen Proteoliposomen. Solche Profile sind von hoher Relevanz für die Wirkstoffentwicklung, da sie grundlegende Eigenschaften der Bindung liefern, wie die Bindungsaffinität, die Stöchiometrie und die enthalpischen sowie entropischen Beiträge. Bemerkenswerterweise sind derartige Daten bisher für keinen membranständigen GPCR verfügbar. Um herauszufinden, wie die Membranasymmetrie die Oligomerisierung von CXCR1 beeinflusst, benutzen wir gepulste Elektronenspinresonanz-Spektroskopie. Hierfür markieren wir einzelne IL-8-Protomere mit Nitroxid-Spinsonden und bestimmen deren Abstände im rezeptorgebundenen Zustand. Dadurch können wir auf die supramolekulare Organisation von CXCR1 rückschließen. Zusätzlich analysieren wir, wie CXCR1 seine Lipidumgebung beeinflusst. Zu diesem Zweck quantifizieren wir mittels ITC die Präferenz verschiedener Lipidspezies, sich in CXCR1-haltige Proteoliposomen einzulagern. Dadurch erhoffen wir uns Erkenntnisse darüber, wie einzelne Lipidumgebungen mit bestimmten supramolekularen Rezeptorverbänden korrelieren, was beispielsweise für die Bildung von Nanodomänen von Bedeutung ist.

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