Record #525470

DFG project G:(GEPRIS)237378576

Oligonukleotid-modifizierte Nukleotide

Coordinator	Professor Dr. Andreas Marx
Grant period	2013 - 2022
Funding body	Deutsche Forschungsgemeinschaft
	DFG
Identifier	G:(GEPRIS)237378576

Note: Die Nukleinsäure-basierte Diagnostik erstreckt sich über ein weites Feld, das von der Detektion von pathogen-abgeleiteten Nukleinsäuren (wie Viren) bis hin zur Analyse einzelner Nukleotidvariationen im gesamten Genom wie Punktmutationen und Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) reicht. Die meisten analytischen Ansätze basieren auf der Polymerase Kettenreaktion (PCR) und erfordern eine anspruchsvolle apparative Ausrüstung. Ziel dieses Projektes ist es, Methoden weiterzuentwickeln, die den Nachweis eines Nukleinsäure-Targets mit dem bloßen Auge mit einer einzigen Nukleotid-Präzision ermöglichen, ohne eine PCR-basierte Technologie zu erfordern. Ein solches System wäre sehr nützlich für Point-of-Care-Tests oder die Erkennung von Krankheitserregern im Feld. DNA-Polymerase-basierte Reaktionen haben in dieser Hinsicht ein großes Potenzial, da sie den Nukleotid-Einbau in eine Templat-abhängige Weise mit hoher Sequenzselektivität katalysieren. In der ersten Förderperiode haben wir gezeigt, dass Nukleotide, die mit großen funktionellen Einheiten zur Signalerzeugung modifiziert sind, wie DNA-Konstrukte mit enzymatischer Aktivität (hier: DNAzyme) oder Proteine (hier: Rettich-Peroxidase), durch DNA-Polymerasen prozessiert und Sequenz-spezifisch in einen wachsenden DNA-Strang eingebaut werden. Dabei werden die funktionalen Einheiten mit festen Trägern verbunden und ermöglichen eine Sequenz-spezifisch Signalgenerierung, die mit bloßem Auge detektierbar ist. Diese Studien wurden durch strukturelle Untersuchungen über den Mechanismus unterstützt, wie solche großen Modifikationen von DNA-Polymerasen akzeptiert werden. In künftigen Studien zielen wir darauf ab, die Sensitivität der Systeme durch die Nutzung von Loop-vermittelten isothermen Amplifikations- (LAMP) und Antikörper-basierten Nachweissystemen zu erhöhen. Erste vorläufige Ergebnisse zeigen, dass beide Ansätze sehr vielversprechend sind. So werden mehrere DNA- und Antikörper-modifizierte Nukleosidtriphosphate synthetisiert und sorgfältig untersucht. Weiterhin wollen wir den Einbau der modifizierten Nukleotide durch DNA-Polymerasen durch funktionelle und strukturelle Mittel sorgfältig untersuchen. Dies führt zur Entwicklung eines breiteren Verständnisses der Mechanismen, mit denen diese Enzyme Nukleotide verarbeiten, die mit Entitäten modifiziert sind, die bis zu mehrmals größer als der Durchmesser der DNA-Polymerasen selbst sind. Auf der anderen Seite werden neue Einblicke in die komplexen Mechanismen, mit denen DNA-Polymerasen funktionieren, aufgrund geplanter struktureller Untersuchungen von relevanten DNA-Polymerasen erhalten, die zuvor nicht mit gebundenen modifizierten Substraten kristallisiert wurden.

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Record created 2023-02-02, last modified 2024-09-27

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