Record #510749

DFG project G:(GEPRIS)469042295

Untersuchungen an den biosynthetischen Enzymen des erdigen Duftstoffes 2-Methylisoborneol

Coordinator	Professor Dr. Jeroen Dickschat
Grant period	2021 -
Funding body	Deutsche Forschungsgemeinschaft
	DFG
Identifier	G:(GEPRIS)469042295

Note: Dieses Projekt hat eine tiefe mechanistische Untersuchung der biosynthetischen Enzyme GPPMT und 2-MIBS für 2-MIB zum Ziel. Diese Biokatalysatoren sollen für die enzymatische Synthese neuer 2-MIB-Analoga zugänglich gemacht werden, indem ihre Substrattoleranz systematisch erweitert wird.Zunächst werden diverse DMAPP- und IPP-Analoga durch chemische Synthese zugänglich gemacht. Ihre Umsetzung zu GPP-Analoga mit FPPS wird untersucht, gefolgt von Versuchen zur Umsetzung mit GPPMT und dann 2-MIBS. Auch enzymatisch gebildete SAM-Derivate werden verwendet, um den erreichbaren Strukturraum zu erweitern. In erfolgreichen Fällen werden die Produkte aus präparativen Inkubationen gereinigt und ihre Strukturen werden per NMR-Spektroskopie aufgeklärt.Eine lumineszenzbasierte Methode wird entwickelt, um effizient Terpensynthaseaktivitäten verfolgen zu können. Terpencyclisierungen liefern Diphosphat als Koppelprodukt, das mit Adenosin-5’-phosphosulfat (APS) durch die Sulfat-Adenylyltransferase zu ATP umgesetzt werden kann, gefolgt von einer Kopplung an die lichtgenerierende Luciferase aus Glühwürmchen (wie im Pyrosequencing eingesetzt). Dieser Aufbau wird zur einfachen Messung der Enzymkinetiken von Terpensynthasen, insbesondere 2-MIBS, optimiert. Zu diesem Zweck müssen Enzymkonzentrationen bestimmt werden, wofür eine fluoreszenzbasierte Methode unter Einsatz des grün fluoreszierenden Proteins entwickelt werden soll.Ortsgerichtete Mutagenese der hochkonservierten Residuen in GPPMT und 2-MIBS werden durchgeführt, um diese Enzyme mechanistisch zu studieren. Für aktive Enzymvarianten wird die Kinetik mit dem Luciferasesystem bestimmt und mit der Wildtypaktivität verglichen. Gerichtete Evolution wird verwendet um die aktiven Zentren und die Substrattoleranz von GPPMT und 2-MIBS für größere Substrate zu erweitern. Eine optimierte 2-MIBS-Variante wird eingesetzt, um 2-MIB mit einem reaktiven Anker wie einer Propargylgruppe zu versehen, der in einer Clickreaktion eingesetzt werden kann. Dies erlaubt es, 2-MIB-Analoga über einen Linker an Biotin zu kuppeln, so dass das ganze Molekül an Streptavidinsepharose immobilisierbar wird. Dies kann dann genutzt werden, um aus Zelllysaten molekulare Proteintargets des 2-MIB herauszufischen. Dies soll mit Zelllysaten der natürlicher bakterieller 2-MIB-Produzenten durchgeführt werden, um zu untersuchen, ob sie selbst über ein Target des Signals 2-MIB verfügen.

Recent Publications

There are no publications

Record created 2023-01-19, last modified 2024-09-27

Similar records

Rate this document:

(Not yet reviewed)

Add to personal basket
Export as Author List with IDs BibTeX (UTF-8), EndNote XML, EndNote Text, RIS, MARC, Print MARC, MARCXML, DC,
Request correction
Submit fulltext

guest :: login PUBDB
		Search		Submit		Personalize Your alerts Your baskets Your searches		Help